ELISA實(shí)驗(yàn)操作中值得關(guān)注的細(xì)節(jié)大盤點(diǎn)

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）因其具有敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)中的各種抗原和抗體的測(cè)定。盡管 ELISA 操作簡(jiǎn)單，但是小實(shí)驗(yàn)里也蘊(yùn)含著大文章，ELISA 操作各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)效果影響較大，稍不注意就會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果?，F(xiàn)在就跟大家 818 應(yīng)用 ELISA 應(yīng)該了解的一些常識(shí)。

ELISA 分類及具體過(guò)程 

一般，ELISA 可分為以下四大類：直接 ELISA、間接 ELISA、夾心 ELISA、競(jìng)爭(zhēng)抑制 ELISA。其他的 ELISA 都隸屬于這四類 ELISA 或由這四類 ELISA 組合衍生。下面分析 ELISA 實(shí)驗(yàn)操作中可能影響結(jié)果的原因，并給出相應(yīng)的解決方法。

樣品收集和保存 

用于 ELISA 測(cè)定較為常用的臨床標(biāo)本是血清（漿）。要注意避免嚴(yán)重溶血，因?yàn)檠t蛋白中含有具有類似過(guò)氧化物活性的血紅素基團(tuán)，在孵育時(shí)很容易吸附于固相，與 HRP 底物反應(yīng)產(chǎn)生假陽(yáng)性。 

樣品采集及血清分離中要注意避免細(xì)菌污染，一方面細(xì)菌分泌的酶可能對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用，另一方面，細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的 β-半乳糖苷酶會(huì)對(duì)相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾。 

樣品應(yīng)該要避免反復(fù)凍融。因反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。另外，樣品混勻時(shí)，不要?jiǎng)×艺袷?，反?fù)顛倒混勻即可。 

一般而言，如果在收集樣品的當(dāng)天進(jìn)行檢測(cè)，可將樣品及時(shí)儲(chǔ)存在 4℃?zhèn)溆?；而?duì)隔天再檢測(cè)的樣本，應(yīng)及時(shí)分裝后凍存在-20℃?zhèn)溆?，若要長(zhǎng)期保存樣品，最好將其置于-70℃凍存。

試劑準(zhǔn)備 

在實(shí)驗(yàn)開始前，需將試劑盒從冰箱中拿出來(lái)在室溫放置 20min，再進(jìn)行測(cè)定，以使試劑盒在 使用前與室溫平衡，也可使溫育時(shí)反應(yīng)孔內(nèi)的溫度能較快的達(dá)到所要求的高度，以滿足測(cè)定 要求。 

其次，目前商品中 ELISA 試劑盒中的洗板液均需在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)其所提供的濃縮液進(jìn)行稀釋 配制，因此稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)該保證質(zhì)量。此外，底物反應(yīng)液應(yīng)該反應(yīng)顯色 前進(jìn)行現(xiàn)配現(xiàn)用。同時(shí)，為了保證實(shí)驗(yàn)的均一性，實(shí)驗(yàn)中所有試劑在加樣前必須搖勻。

加樣 

因 ELISA 的靈敏度較高，則應(yīng)該按規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，以降低非特異性反應(yīng)，使特異性的抗原抗體反應(yīng)充分體現(xiàn)出來(lái)。 

加樣品時(shí)，單孔用量要求：≥20ul/指標(biāo)，如需要做 2 個(gè)復(fù)孔則血量≥60ul/指標(biāo)。如果用量充足，最好提供 50ul/孔/指標(biāo)。具體用量也需根據(jù)試劑盒的要求而定。 

吸取樣品時(shí)，加樣槍頭不應(yīng)粘附多余的液體；加樣時(shí)不可 90 度向孔中滴加液體，否則會(huì)導(dǎo)致液體殘留在吸頭上，加樣不準(zhǔn)確。正確加樣方法應(yīng)為 45 度，吸頭貼著孔壁和液面的交界處加入。

加樣時(shí)速度不可過(guò)快，否則無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性；要避免樣品加在孔壁上部而產(chǎn)生非特異性吸附。不可將樣品濺出以避免對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。

孵育 

一般，孵育時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，所需時(shí)間相對(duì)較短。較為常用的孵育溫度為 37℃，孵育 1-2h。 

孵育時(shí)應(yīng)貼封片或加蓋，避免樣品或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗。孵育時(shí)，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。同時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格控制孵育時(shí)間，避免因時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致緊附于反應(yīng)孔周圍的非特異性結(jié)合。 

孵育時(shí)，要盡量排除“邊緣效應(yīng)"，即 96 孔板的外周孔顯色較中心孔深。究其原因，是因?yàn)?96 孔板周孔與中心孔的表面或熱力學(xué)特征不同。因此，可采用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí)，將板和溶液均加熱至孵育溫度（37℃）。

洗板 

為了確保 ELISA 測(cè)定的特異性，洗板可清除非特異性結(jié)合物質(zhì)，減少背景信號(hào)，增加分析的信噪比。 

手工洗板時(shí)，拍板要垂直，避免交叉污染，用力不能過(guò)猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫離。使用半自動(dòng)洗板時(shí)，應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時(shí)可用注射器針頭挑出。為了達(dá)到較好的洗滌效果，實(shí)驗(yàn)室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法，即在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板 1-2 次。

以 HRP 作為標(biāo)記酶的 ELISA 試劑盒中使用的洗板液一般為含 0.05% Tween20 的中性 PBS，其中，吐溫 20 的濃度可在 0.05%-0.2%之間，高于 0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低實(shí)驗(yàn)的靈敏度。

顯色 

目前以 HRP 作為標(biāo)記酶的商品 ELISA 試劑盒中，如以 TMB 為底物，則提供的底物為 A 和 B 兩瓶應(yīng)用液；如以 OPD 為底物，則試劑盒提供 OPD 片劑或粉劑，臨用前配制。顯色劑配制后放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（肉眼可見淺藍(lán)色的 TMB 時(shí)）要棄之不用。 

在加入底物開始顯色反應(yīng)前，最好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將 A 和 B 兩種液各加一滴于清潔的空板孔或 eppendorf 管中，觀察是否有顯色出現(xiàn)，如有，則說(shuō)明底物已變質(zhì)。 

顯色反應(yīng)條件一般為 37℃或室溫反應(yīng) 15-30 分鐘。加終止液時(shí)，要避免氣泡產(chǎn)生而引起的假陽(yáng)性。

讀板 

讀板時(shí)要保證酶標(biāo)板清潔，同時(shí)也要注意酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)是否已調(diào)至合適或所用濾光片是否正確。 

通常，單波長(zhǎng)讀板的測(cè)定值一般是指以對(duì)顯色具有最大吸收的波長(zhǎng)如 450nm 或 492nm 進(jìn)行比色測(cè)定；而雙波長(zhǎng)讀板的測(cè)定值一般是敏感波長(zhǎng)如 450nm 的吸光值與非敏感波長(zhǎng)下如 630nm 的吸光值之差，可排除板內(nèi)臟物的影響。 

同時(shí)，由于 ELISA 測(cè)定中單個(gè)空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說(shuō)每次測(cè)定或同次測(cè)定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測(cè)定值，故而在 ELISA 測(cè)定比色時(shí)，最好是使用雙波長(zhǎng)比色。

數(shù)據(jù)結(jié)果分析 

ELISA 的測(cè)定結(jié)果可分為兩種：定性測(cè)定和定量測(cè)定。前者只需確定陰性或陽(yáng)性即可；后者則需要給具體的數(shù)值。在定量測(cè)定中，經(jīng)常要將標(biāo)準(zhǔn)品所獲得的吸光值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。 

下面則簡(jiǎn)單介紹用 excel 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法 

1）輸入相應(yīng)數(shù)據(jù)

2）選中相應(yīng)數(shù)據(jù)

3）選擇表格中，菜單欄中的插入|散點(diǎn)圖中第一個(gè)類型

4）選中“圖表工具"中的“快速布局"中 fx 圖標(biāo)，即可得到以下圖表。Excel 版本較低的可以直接跳到第 6）步。

5）點(diǎn)中坐標(biāo)軸標(biāo)題，可做修改。修改后可獲得以下標(biāo)準(zhǔn)曲線。

6）或者在較低版本的 excel 中，在“圖表工具"選項(xiàng)中，選擇趨勢(shì)線|線性趨勢(shì)線。

7）選中圖表中的趨勢(shì)線，右鍵，選擇“設(shè)置趨勢(shì)線格式"，在彈出的對(duì)話框中，將“顯示公式" 勾選上，點(diǎn)擊關(guān)閉，也獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

8）可將試驗(yàn)管中所測(cè)的吸光度值代入圖表中的公式 Y=1.001x+0.0171 后可得到所求成分的含量，即 X 的值。

ELISA 的疑難雜癥 

1）顯色淺，靈敏度低

2）假陽(yáng)性多，本底高甚至花板

3）重復(fù)性不好

4）白板