細(xì)胞培養(yǎng)無小事——細(xì)胞培養(yǎng)的主要步驟

 一個(gè)小細(xì)胞可能會把人弄得吃不下，睡不著，焦頭爛額？？？信不信還真的有這樣的事情 ，可能整個(gè)實(shí)驗(yàn)下來計(jì)劃是三個(gè)月左右，但實(shí)際有時(shí)候出手的第一步就遇到了攔路虎，why？細(xì)胞總是養(yǎng)不好；天啊，馬上就到了三個(gè)月了，SO sad，下面我們就來看看細(xì)胞主要的培養(yǎng)步驟吧。

選對培養(yǎng)基很重要：

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，一般首先選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開始，各種目的無血清培養(yǎng)最好首先選的培養(yǎng)基。 

GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？

GlutaMAX-I 二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎*降解。

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？

丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。 

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。 

大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。這個(gè)特別在血清上體現(xiàn)的很明顯，有些血清沉淀特別多，客服都會告訴您這個(gè)是血清的析出蛋白，讓您不要離心直接使用也是這個(gè)原理 ，因?yàn)殡x心之后您的血清連那么點(diǎn)營養(yǎng)蛋白都沒有啦 

38 在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定 

同時(shí)細(xì)胞的狀態(tài)也非常重要，有些老師認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞反正可以無限傳代，那么我就用之前傳過188代的細(xì)胞來做實(shí)驗(yàn)又如何，要是細(xì)胞的形態(tài)好，可能真的沒有什么問題，但是若細(xì)胞形態(tài)也不行，那要考慮是否用這個(gè)細(xì)胞了 ，一般細(xì)胞的形態(tài)不好涉及到三個(gè)方面：1.培養(yǎng)基使用的不對嚴(yán)重改變細(xì)胞的營養(yǎng)環(huán)境，細(xì)胞為自救不得不變異以求生長；2.操作手法不對，造成細(xì)胞污染等，3.傳代次數(shù)太多，因?yàn)槊看蝹鞔紩o細(xì)胞造成輕微的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞在傳代之后不斷的修復(fù)，修復(fù)的細(xì)胞需要的衍生物，比如血清，培養(yǎng)基，可能會根據(jù)配方和批次的不同，給細(xì)胞造成不同程度的變異。

So easy的操作手法：

第一見細(xì)胞的時(shí)候，都不知道從何入手，太嬌貴了 ，怎么辦？其實(shí)，我們只要記住一點(diǎn)就可以了：無菌操作，無菌操作，無菌操作，重要的事情說三遍，之后我們就可以放開手腳，大干一場了。 

Step 1 ： 冷凍管應(yīng)如何解凍？

取出冷凍管后，須立即放入37 C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。注意：復(fù)蘇不一定要離心，除少數(shù)特別注明對DMSO敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可。

如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。 

Step 2:怎么培養(yǎng)？

培養(yǎng)關(guān)鍵點(diǎn)還在傳代操作，一想到傳代，天啊 ，會不會很復(fù)雜？首先我們要等到細(xì)胞到達(dá)80%-85%的密度再進(jìn)行操作，為什么是這個(gè)密度？因?yàn)檫@個(gè)密度剛好是細(xì)胞生長的鼎盛期，因?yàn)榧?xì)胞和細(xì)胞間都會有信號通路互相聯(lián)系，這個(gè)時(shí)候他們都共同商量好了要努力生長，然后傳代之后，他們看到空間還是這么大，就會把努力生長的精神一直傳承下去，直到他們過了生長鼎盛期到生長平頂期為止。當(dāng)然有些貪婪的聚集成簇生長的細(xì)胞，他們會不辭辛苦，日以繼日的生長，直到培養(yǎng)基不能給他們提供一點(diǎn)養(yǎng)分為止。 

Step 3:不可忽略的重要的傳代過程：

1.37度水浴加熱*培養(yǎng)基，0.25% 胰蛋白酶/EDTA溶液，我們不建議在37度溫度下加熱試劑和培養(yǎng)基，水浴優(yōu)先使用。

2. 用DPBS沖洗細(xì)胞，并倒掉洗過的DPBS。

3. 加入1 ml 0.25% T/E溶液裝入T-25瓶中。輕輕搖動燒瓶，以確保T/E溶液*覆蓋細(xì)胞。用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

4.。在孵育期間，準(zhǔn)備一個(gè)15毫升的錐形離心管與5ml胰酶中止液

5.在消化時(shí)，輕輕敲打培養(yǎng)瓶的側(cè)面，將細(xì)胞從表面剝離出來。在顯微鏡下檢查，確保所有的細(xì)胞間隙變大并且都開始呈流沙狀脫落。

6.. 向培養(yǎng)瓶中加入5 ml胰酶中止液，將分離的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml離心管中。用另外5 mll胰酶中止液清洗培養(yǎng)瓶以收集殘留的細(xì)胞。

7.將15毫升離心管以1000 rpm離心5分鐘，收集消化好的細(xì)胞沉淀。

8.將細(xì)胞沉淀分別滴入我們要分瓶的容器里，完成傳代。