關(guān)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，這幾點(diǎn)必須要清楚

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如 DNA RNA 等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。可分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染等

    瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是指外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其他調(diào)控元件的分析。一般來(lái)說(shuō)，超螺旋質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后 24-72 h 內(nèi)分析結(jié)果，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來(lái)幫助檢測(cè)。

    穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指外源 DNA 既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體存在。盡管線(xiàn)性 DNA 比超螺旋 DNA 轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色體中概率很小，通常需要一些選擇性標(biāo)記反復(fù)篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。

主要有下面幾種方法：

化學(xué)法：磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽(yáng)離子脂質(zhì)體法；物理法：電穿孔法、顯微注射法、biolistic 顆粒傳遞法；病毒介導(dǎo)法：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒

A. 陽(yáng)離子脂質(zhì)體法：

    帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。過(guò)程如下圖：

   特點(diǎn)：

    簡(jiǎn)單通用，適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清，轉(zhuǎn)染效率隨細(xì)胞類(lèi)型變化大。由于脂質(zhì)體復(fù)合物與貼壁細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)遠(yuǎn)大于懸浮細(xì)胞，所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高。懸浮細(xì)胞建議使用電穿孔法。

B. 電穿孔法：

    利用高壓電脈沖對(duì)細(xì)胞膜的干擾，使其形成利于核酸進(jìn)入的微孔。

C. 逆轉(zhuǎn)錄病毒（RNA）：

    通過(guò)病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用進(jìn)入宿主細(xì)胞，之后反轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)合成 DNA 并隨機(jī)整合到宿主基因組中。

    特點(diǎn)：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等，但攜帶基因不能太大。

D. 腺病毒（雙鏈 DNA）：

    先和細(xì)胞表面的受體結(jié)合，繼而在αV 整合素介導(dǎo)下被細(xì)胞內(nèi)吞。

    特點(diǎn)：可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

    影響轉(zhuǎn)染的因素：

    血清 血清影響復(fù)合物的形成，降低轉(zhuǎn)染效率

    陽(yáng)離子脂質(zhì)體和 DNA 的最佳量在使用血清時(shí)會(huì)有所不同，因此想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清時(shí)要進(jìn)行條件優(yōu)化。大部分細(xì)胞可以在無(wú)血清培養(yǎng)基中幾個(gè)小時(shí)內(nèi)保持健康，對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的細(xì)胞，可以使用 OPTI-MEM I 培養(yǎng)基。對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞，建議使用 LIPOFECTAMINE 2000。

    抗生素

    比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對(duì)于真核細(xì)胞無(wú)毒，但陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。

    細(xì)胞代數(shù)

    轉(zhuǎn)染前細(xì)胞最好經(jīng)過(guò) 1-2 次傳代保證細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛容易轉(zhuǎn)染，注意貼壁細(xì)胞一旦長(zhǎng)滿(mǎn)就不好轉(zhuǎn)染。

    細(xì)胞鋪板密度

    一般轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞密度為 70%-90%，懸浮細(xì)胞密度為 2*10^6--4*10^6 細(xì)胞/ml 時(shí)效果較好。確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒(méi)有長(zhǎng)滿(mǎn)或處于靜止期。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。

    DNA 質(zhì)量

    DNA 質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)基于電荷吸引原理，如果 DNA 不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成和轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。

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