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    如何做好細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇?

    發(fā)布時間: 2021-12-07  點(diǎn)擊次數(shù): 1793次

    1.準(zhǔn)備工作:

    根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的特性,提前準(zhǔn)備好適合的培養(yǎng)基和血清等。最好沿用細(xì)胞原來的培養(yǎng)條件,以免細(xì)胞在新環(huán)境下還需要過渡適應(yīng)。同時,充分了解到細(xì)胞的生長特性和形態(tài)特征,便于后續(xù)的培養(yǎng)觀察。


    2.貼壁細(xì)胞傳代:

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    1)移棄使用過的細(xì)胞培養(yǎng)液。(不要直接倒掉,避免瓶口殘留導(dǎo)致易污染)

    2)使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液(PBS)沖洗細(xì)胞。從與貼壁細(xì)胞層相對的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液,以避免攪動細(xì)胞層,前后搖晃容器數(shù)次,最后移棄沖洗液。(洗去殘留的血清,避免影響胰酶的活性。)

    3)以 25 cm2的培養(yǎng)瓶為例,向瓶內(nèi)加入1ml胰蛋白酶-EDTA(請根據(jù)各細(xì)胞的指引使用合適的濃度)消化液,輕輕搖動培養(yǎng)瓶,使消化液流遍所有細(xì)胞表面,放到37 ℃ 孵育。通常,幾分鐘內(nèi),會發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大,傾斜培養(yǎng)瓶時細(xì)胞層能自然流下,此時應(yīng)加入2-3ml含血清的*培養(yǎng)液終止消化(細(xì)胞解離所需時間請參考各細(xì)胞的指引,并建議每隔30秒在顯微鏡下觀察細(xì)胞的解離情況)。另外,并不是所有貼壁細(xì)胞都適用采用胰蛋白酶進(jìn)行解離,請根據(jù)各細(xì)胞的指引選擇合適的解離方法。

    4)使培養(yǎng)瓶傾斜,吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)液體輕輕沖向原細(xì)胞生長表面,重復(fù)該動作2-3次,使所有細(xì)胞沿瓶底流下,再輕柔地把細(xì)胞吹打成單個懸液(吹打過程中應(yīng)避免氣泡的產(chǎn)生)。

    PS:對于難消化的細(xì)胞,盡量不要通過用力吹打的方式來處理,以免對細(xì)胞產(chǎn)生物理損傷??梢韵葘⒁呀?jīng)消化的細(xì)胞分出來,及時終止消化。然后再對仍然貼壁的細(xì)胞進(jìn)行再次消化。做到分層消化,避免易消化細(xì)胞長時間在胰酶消化下受損。

    5)把所有的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,800-1000rpm離心3-5分鐘后移棄上清。

    6)加入新的含血清*培養(yǎng)液重懸成單細(xì)胞懸液。按各細(xì)胞指引推薦的傳代比例,把細(xì)胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中,補(bǔ)足新的含血清*培養(yǎng)液,輕輕搖晃混勻。

    7)放到37 ℃ 孵育,第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁情況。

     

    3.懸浮細(xì)胞傳代:

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    因懸浮生長細(xì)胞不貼壁,故傳代時不必采用酶消化方法,而可直接傳代或離心收集細(xì)胞后傳代。

    1)直接傳代時,靜置5-10分鐘,待懸浮細(xì)胞慢慢沉淀到器皿底部后,吸掉1/2-2/3原培養(yǎng)液,補(bǔ)足新鮮的含血清*培養(yǎng)液,混勻成細(xì)胞懸液。按各細(xì)胞指引推薦的傳代比例,把細(xì)胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中,輕輕搖晃混勻。

    2)離心傳代時,將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi),800-1000rpm離心3-5分鐘,移棄上清后,加入新鮮的含血清*培養(yǎng)液重懸。按各細(xì)胞指引推薦的傳代比例,把細(xì)胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中,補(bǔ)足新鮮的含血清*培養(yǎng)液,輕輕搖晃混勻。

    3)放到37 ℃ 孵育,第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞的情況。

     

    4.貼壁懸浮混合型細(xì)胞傳代:

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    先將懸浮的細(xì)胞收集,再參考“貼壁細(xì)胞傳代"方法進(jìn)行消化收集,一起接種到培養(yǎng)器皿中。

    PS: 懸浮細(xì)胞生長中一般對細(xì)胞密度要求比較高,培養(yǎng)中最好參考指南控制好細(xì)胞密度,不能過密也不能過稀。

     

    5.細(xì)胞凍存:

    1)按照“細(xì)胞傳代步驟"中的方法收集細(xì)胞。

    2)加入細(xì)胞凍存液(一般10%DMSO+對應(yīng)細(xì)胞的*培養(yǎng)液),使細(xì)胞的終密度為(5~10)×105個/ml,移入細(xì)胞凍存管中。

    3)程序降溫(以使用需異丙醇的Nalgene程序降溫盒為例):4℃ 30min→-80℃過夜→液氮。(一定不能省略4℃的30min,否則凍存液無法滲透到細(xì)胞,易產(chǎn)生冰晶導(dǎo)致細(xì)胞受損。)

     

    6.細(xì)胞復(fù)蘇:

    1)取出貯存的細(xì)胞,待液氮揮發(fā)后,馬上37℃水浴中輕輕搖動使快速融化(通常2min內(nèi),時間長了細(xì)胞狀態(tài)會受影響)。為避免劇烈的溫差變化導(dǎo)致凍存管炸裂,操作該步時請配戴防護(hù)面罩或防護(hù)目鏡。

    PS:干冰運(yùn)輸?shù)膬龃婕?xì)胞,收到后需要立刻放入深低溫冰箱或液氮中,至少3d后再進(jìn)行復(fù)蘇操作。

    2)轉(zhuǎn)移到無菌操作臺,75%酒精擦拭凍存管外部。

    3)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到裝有10-20ml經(jīng)預(yù)熱的含血清*培養(yǎng)液離心管中,800-1000rpm離心3-5分鐘,移棄上清。

    4)重新加入經(jīng)預(yù)熱的含血清*培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,以約(3~5)×105個/ml密度接種到培養(yǎng)器皿中。

    5)放到37℃孵育,第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞的情況。


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