如何做好細胞的培養(yǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇？

1.準(zhǔn)備工作：

根據(jù)培養(yǎng)細胞的特性，提前準(zhǔn)備好適合的培養(yǎng)基和血清等。最好沿用細胞原來的培養(yǎng)條件，以免細胞在新環(huán)境下還需要過渡適應(yīng)。同時，充分了解到細胞的生長特性和形態(tài)特征，便于后續(xù)的培養(yǎng)觀察。

2.貼壁細胞傳代：

1）移棄使用過的細胞培養(yǎng)液。（不要直接倒掉，避免瓶口殘留導(dǎo)致易污染）

2）使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液（PBS）沖洗細胞。從與貼壁細胞層相對的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液，以避免攪動細胞層，前后搖晃容器數(shù)次，最后移棄沖洗液。（洗去殘留的血清，避免影響胰酶的活性。）

3）以 25 cm2的培養(yǎng)瓶為例，向瓶內(nèi)加入1ml胰蛋白酶-EDTA（請根據(jù)各細胞的指引使用合適的濃度）消化液，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細胞表面，放到37 ℃ 孵育。通常，幾分鐘內(nèi)，會發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大，傾斜培養(yǎng)瓶時細胞層能自然流下，此時應(yīng)加入2-3ml含血清的*培養(yǎng)液終止消化（細胞解離所需時間請參考各細胞的指引，并建議每隔30秒在顯微鏡下觀察細胞的解離情況）。另外，并不是所有貼壁細胞都適用采用胰蛋白酶進行解離，請根據(jù)各細胞的指引選擇合適的解離方法。

4）使培養(yǎng)瓶傾斜，吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)液體輕輕沖向原細胞生長表面，重復(fù)該動作2-3次，使所有細胞沿瓶底流下，再輕柔地把細胞吹打成單個懸液（吹打過程中應(yīng)避免氣泡的產(chǎn)生）。

PS：對于難消化的細胞，盡量不要通過用力吹打的方式來處理，以免對細胞產(chǎn)生物理損傷?？梢韵葘⒁呀?jīng)消化的細胞分出來，及時終止消化。然后再對仍然貼壁的細胞進行再次消化。做到分層消化，避免易消化細胞長時間在胰酶消化下受損。

5）把所有的細胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后移棄上清。

6）加入新的含血清*培養(yǎng)液重懸成單細胞懸液。按各細胞指引推薦的傳代比例，把細胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中，補足新的含血清*培養(yǎng)液，輕輕搖晃混勻。

7）放到37 ℃ 孵育，第二天顯微鏡下觀察細胞的貼壁情況。

3.懸浮細胞傳代：

因懸浮生長細胞不貼壁，故傳代時不必采用酶消化方法，而可直接傳代或離心收集細胞后傳代。

1）直接傳代時，靜置5-10分鐘，待懸浮細胞慢慢沉淀到器皿底部后，吸掉1/2-2/3原培養(yǎng)液，補足新鮮的含血清*培養(yǎng)液，混勻成細胞懸液。按各細胞指引推薦的傳代比例，把細胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中，輕輕搖晃混勻。

2）離心傳代時，將細胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，800-1000rpm離心3-5分鐘，移棄上清后，加入新鮮的含血清*培養(yǎng)液重懸。按各細胞指引推薦的傳代比例，把細胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中，補足新鮮的含血清*培養(yǎng)液，輕輕搖晃混勻。

3）放到37 ℃ 孵育，第二天顯微鏡下觀察細胞的情況。

4.貼壁懸浮混合型細胞傳代：

先將懸浮的細胞收集，再參考“貼壁細胞傳代"方法進行消化收集，一起接種到培養(yǎng)器皿中。

PS: 懸浮細胞生長中一般對細胞密度要求比較高，培養(yǎng)中最好參考指南控制好細胞密度，不能過密也不能過稀。

5.細胞凍存：

1）按照“細胞傳代步驟"中的方法收集細胞。

2）加入細胞凍存液（一般10%DMSO+對應(yīng)細胞的*培養(yǎng)液），使細胞的終密度為(5~10)×105個/ml，移入細胞凍存管中。

3）程序降溫（以使用需異丙醇的Nalgene程序降溫盒為例）：4℃ 30min→-80℃過夜→液氮。（一定不能省略4℃的30min，否則凍存液無法滲透到細胞，易產(chǎn)生冰晶導(dǎo)致細胞受損。）

6.細胞復(fù)蘇：

1）取出貯存的細胞，待液氮揮發(fā)后，馬上37℃水浴中輕輕搖動使快速融化（通常2min內(nèi)，時間長了細胞狀態(tài)會受影響）。為避免劇烈的溫差變化導(dǎo)致凍存管炸裂，操作該步時請配戴防護面罩或防護目鏡。

PS：干冰運輸?shù)膬龃婕毎盏胶笮枰⒖谭湃肷畹蜏乇浠蛞旱?，至?d后再進行復(fù)蘇操作。

2）轉(zhuǎn)移到無菌操作臺，75%酒精擦拭凍存管外部。

3）將細胞懸液轉(zhuǎn)移到裝有10-20ml經(jīng)預(yù)熱的含血清*培養(yǎng)液離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘，移棄上清。

4）重新加入經(jīng)預(yù)熱的含血清*培養(yǎng)液重懸細胞，以約(3~5)×105個/ml密度接種到培養(yǎng)器皿中。

5）放到37℃孵育，第二天顯微鏡下觀察細胞的情況。

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