薄層層析法測(cè)定氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶含量實(shí)驗(yàn)

步驟

材料

緩沖液和溶液
貯存液、緩沖液和試劑的組分請(qǐng)見(jiàn)附錄 1。
貯存液稀釋到適當(dāng)濃度。

CAT 反應(yīng)混合物 1
1mol/LTris-Cl(pH7.8)50ul
[14C] 氯霉素 (60mCi/mmol, 用水稀釋到 0.1mCi/ml)10ul
乙酰輔酶 A(新鮮配制，水溶液濃度 3.5 mg/ml)20ul
每測(cè)定 50ul 細(xì)胞裂解物需要準(zhǔn)備 80ulCAT 反應(yīng)混合物。反應(yīng)混合物在臨用前配制。
乙酰酶 A 是輔酶 A 的 S-乙酰基化形式。兩個(gè)碘單位以這種形式從脂肪和碳水化合物進(jìn)入檸檬酸循環(huán)。乙酰輔酶 A 在很多生物反應(yīng)中作為乙?；妮o助因子，如在本方案中，通過(guò) CAT 使氯霉素?；托枰阴］o酶 A 作為輔助因子。

乙基乙酸
乙基乙酸（CH2COOCH2CH3) 是用于 CAT 活性薄層層析測(cè)定的有機(jī)溶劑。1 份乙基乙酸和 19 份氯仿混合制成的溶劑可以把乙?；头且阴；问降穆让顾卦诠枘z板上分開(kāi)。乙基乙酸是非常易燃（閃燃點(diǎn)=-4°C) 的揮發(fā)性酯類(lèi)，有成熟水果的味道。



裂解緩沖液
0.1mol/LTris-Cl（pH7.8)
0.5%(V/V)TritonX-100
通過(guò)去污劑裂解細(xì)胞時(shí)使用（請(qǐng)見(jiàn)步驟 4)。
同樣的裂解緩沖液可制備用于測(cè)量β-半乳糖苷酶活性的細(xì)胞抽提物（請(qǐng)見(jiàn)方案 7）。
重要：細(xì)胞裂解緩沖液需用髙純度的 TritonX-100 制品。低等級(jí)的去污劑會(huì)抑制 CAT 酶活性。裂解緩沖液中可以用去污劑0.125%(V/V) 的 NonidetP-40 代替 TritonX-100。

不含鈣鹽和鎂鹽的磷酸鹽緩沖液（PBS)

薄層層析（TLC) 溶劑
190 ml 氯仿
10 ml 甲醇
毎個(gè) TLC 槽需要準(zhǔn)備 200 ml。每個(gè)槽可以用兩個(gè) TLC 板。

Tris-Cl(1mol/L,pH7.8)

放射性化合物

放射性墨水
用于作點(diǎn)標(biāo)記，指示 TCL 柜放射自顯影圖的方向。

特殊設(shè)備

干冰/乙醇浴
用于凍融法裂解細(xì)胞。

使用不溶于乙醇的墨水的記號(hào)筆

旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器
例如 Savant Speed Vac 牌。

橡膠棒

薄層層析板（例如 Sybron SIL G/UV254,Brinkmann 公司）

薄層層析槽（27.5 cm X27.5 cm X7.5 cm)
科學(xué)供應(yīng)品商店提供這類(lèi)槽（如 Sigma-Aldrich Techware 公司)。

預(yù)設(shè)為 65°C 的水浴

細(xì)胞和組織

用攜帶感興趣 DNA 的 pCAT 載體轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞
需要用一個(gè) CAT 報(bào)道分子載體（如 pCAT3 系列）和帶有β-半乳糖苷酶基因（pCMV-SPORT-β-gal；請(qǐng)見(jiàn)第 16 章圖 16-2) 或其他適于使 CAT 測(cè)量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化的報(bào)進(jìn)基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染（使用第 16 章中的某種轉(zhuǎn)染方案）細(xì)胞。pCAT 系列載體的詳細(xì)情況請(qǐng)見(jiàn)圖 17-3。

方法

轉(zhuǎn)染細(xì)胞沉淀的制備

1. 從經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染并在 90 mm 組織培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)的單層細(xì)胞輕輕地吸掉培養(yǎng)液。單層細(xì)胞用 5 ml 不含鈣鹽和鎂鹽的 PBS 洗 3 次。

2. 把培養(yǎng)皿以某個(gè)角度放置 2~3 min，使最后殘留的 PBS 流到一側(cè)。吸掉 PBS 殘液。每個(gè)培養(yǎng)皿加 lmlPBS，用橡膠棒把細(xì)胞刮到離心管中。冰浴，直到所有的培養(yǎng)皿處理完畢。

3. 室溫下以最大速度離心 10s 收集細(xì)胞。用 lml 冰冷的 PBS 輕輕地重懸細(xì)胞沉淀，然后再次離心收集細(xì)胞。去掉細(xì)胞沉淀與管壁中的 PBS 殘液。細(xì)胞沉淀可以貯存在-20°C 以作將來(lái)分析用，也可以用步驟 4 的某種方法制備細(xì)胞抽提物。
用連有真空管的一次性吸頭可以很方便地去除 PBS。吸頭接觸液面，緩緩地吸。當(dāng)液體下降的時(shí)候. 使吸頭盡可能地遠(yuǎn)離細(xì)胞沉淀，然后用吸頭吸掉沾附在管壁上的液滴。

制備細(xì)胞抽提物

4. 裂解細(xì)胞是用反復(fù)凍融法或用含有去污劑的緩沖液處理細(xì)胞。后一種方法快速簡(jiǎn)便，而且適用于在 96 孔板上測(cè)量 CAT、β-半乳糖苷酶和其他標(biāo)記基因（方案 6）(Bignon et al.1993)。

反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞

a. 在 90 mm 培養(yǎng)皿中，用 l00ul 0.25mol/L Tris-Cl(pH7.8) 重懸細(xì)胞沉淀。劇烈振蕩打散細(xì)胞團(tuán)塊。

b. 細(xì)胞在干冰/乙醇浴中凍，在 37°C 融解，并進(jìn)行 3 個(gè)循環(huán)以破壞細(xì)胞。確定管子事先用不溶于乙醇的墨水進(jìn)行過(guò)標(biāo)記。

c. 破碎的細(xì)胞在 4°C 以最大速度離心 5 min。上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。取 50ul 上清用于測(cè)量 CAT, 余下的抽提物貯存于-20°C。

用含有去污劑的緩沖液裂解細(xì)胞

a. 步驟 3 中的細(xì)胞沉淀用 500ul 裂解緩沖液重懸。混合物在 37°C 孵育 15 min。
在 35 mm 培養(yǎng)血中生長(zhǎng)的細(xì)胞抽提時(shí)需要用 100ul 裂解緩沖液。

b. 以最大速度離心 10 min 去除細(xì)胞碎片?；厥丈蠝[。選用一種本方案所述的方法來(lái)測(cè)量 CAT 活性。余下清亮的裂解物在液氮中速凍，然后貯存在-70°C。

用薄層層析法測(cè)定 CAT 活性

5.50ul 細(xì)胞抽提物在 65°C 孵育 10 min 使內(nèi)源性的去乙?；甘Щ睢Ｈ绻@時(shí)候抽提物混濁不透明，在 4°C 最大速度離心 2 min 以去除微粒。

6. 每個(gè)待測(cè)樣品用 80ulCAT 反應(yīng)混合物 1 混合，37°C 孵育。孵育時(shí)間的長(zhǎng)短與細(xì)胞抽提物中 CAT 的濃度有關(guān)，而 CAT 的濃度又與所研究的啟動(dòng)子強(qiáng)度和細(xì)胞類(lèi)型有關(guān)。大多數(shù)情況下，孵育 30 min 到 2 h 就足夠了。
如果轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中 CAT 基因表達(dá)很低，這步反應(yīng)可以孵育更長(zhǎng)的時(shí)間（最長(zhǎng)至 16 h)。但最在這種情況下，建議毎個(gè)反應(yīng)孵育 2 h 后再補(bǔ)加 10ul 乙酰輔酶 A。

7. 每個(gè)樣品加 lml 乙基乙酸，振蕩 3 次，每次 10s, *使溶液混勻?；旌衔镌谑覝叵乱宰畲笏俣入x心 5 min。
乙酰基化的氯霉素進(jìn)入到有機(jī)相（上層）中；非乙酰基化的氯霉素仍留在水相中。

8. 用移液管把 900ul 有機(jī)相轉(zhuǎn)移到新管中，小心避免水相和中間相混入。把含有下層相的管子作為放射性廢物丟棄。

9. 把管子放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（如 Savant SpeedVac 牌), 真空下使乙基乙酸揮發(fā)約 lh。

10. 每個(gè)管子加 25ul 乙基乙酸，輕輕振蕩，使反應(yīng)產(chǎn)物溶解。

11. 把 10~15ul 已溶解的反應(yīng)產(chǎn)物加到 25 mm 硅膠 TLC 板的起點(diǎn)處。板上的起點(diǎn)用軟石墨鉛筆標(biāo)記。每次加樣 5ul, 用吹風(fēng)機(jī)把樣品吹干。

12. 準(zhǔn)備盛有 200 mlTCL 溶劑的 TCL 槽。把 TCL 板放進(jìn)槽中，關(guān)上容器，然后使溶劑前沿移動(dòng)到板上端大約 75% 的地方。
可以用許多不同的 TCL 板和指劑來(lái)分離乙酰基化的氯霉素。我們通常用氯仿：甲醇 (95:5) 和 Sybron SILG/UV254(Brinkmann 公司）TCL 板。Touchstone(1992) 對(duì) TCL 方法及其疑難問(wèn)題作了很好的介紹和說(shuō)明。

13. 把 TCL 板從槽中取出來(lái)，在室溫下干燥。用放射性墨水在 TCL 板上作點(diǎn)標(biāo)記以便于對(duì)齊板與膠片的位置，然后用板對(duì) X 射線(xiàn)膠片曝光。或者把板放在磷屏分析的盒子里。盒子在室溫下放置適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。
TCL 板上不要蓋 Satan 膜，因?yàn)樯w上膜之后會(huì)隔斷 14C 同位素發(fā)出的較弱的放射線(xiàn)。

14. 沖洗 X 射線(xiàn)膠片并與 TCL 板校對(duì)位置。此外，還可以用層析圖對(duì)磷屏分析設(shè)備的圖像板曝光或把 TCL 板拿去掃描。
通?？煽吹饺齻€(gè)放射性斑點(diǎn)。從起點(diǎn)遷移距離最近的點(diǎn)是進(jìn)入乙基乙酸的非乙酰基化的氯霉素。另兩個(gè)遷移得稍快的斑點(diǎn)是兩個(gè)潛在的可酰基化位置中的某一個(gè)被乙?；穆让顾?。只有當(dāng)使用了高濃度 CAT 或用大量抽提蛋白進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的孵育后，才能看到遷移得更快的第三種斑點(diǎn)，它是雙乙?；穆让顾?。

15. 為了對(duì) CAT 活性定量，需要從 TCL 板中把放射性斑點(diǎn)切下來(lái)，然后用液閃計(jì)數(shù)器測(cè)定放射性量（請(qǐng)見(jiàn)附錄 9）。取另一份細(xì)胞抽提物（來(lái)自前面的步驟 3)，用 Bradford 分析法等快速比色法確定抽提物中的蛋白濃度。測(cè)定蛋白濃度前，把 Triton X-100 的濃度稀釋為≤0.1%, 以免發(fā)生交叉反應(yīng)。CAT 活性表示為每單位時(shí)間每毫克細(xì)胞抽提物蛋白中產(chǎn)生乙酰基化產(chǎn)物的皮摩爾數(shù)。
當(dāng)處理大量樣品時(shí)，先硅膠薄層度析，接著切膠和對(duì)修飾過(guò)的氯霉素產(chǎn)物進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)的方法會(huì)變得非常膩味，這些情況下進(jìn)行產(chǎn)物定量的另一種方法是用磷屏設(shè)備對(duì) TCL 板進(jìn)行掃描。
在不含細(xì)胞抽提物的情況下仍然「固有」的氯霉素己酰基化可能會(huì)形成背景。如果這會(huì)有問(wèn)題，試著把實(shí)驗(yàn)中氯霉素的濃度降低 2-4 倍（Heard et al.1987)。