細胞轉(zhuǎn)染技術原理及應用（瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染）

常規(guī)轉(zhuǎn)染技術可分為兩大類，一類是瞬時轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永（jiu）轉(zhuǎn)染）。前者外源DNA/RNA 不整合到宿主 染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其它 調(diào)控元件的分析。

一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72 小時內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分 析結(jié)果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β 半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA 既可以整 合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。

盡管線性DNA 比超螺旋DNA 轉(zhuǎn)入量低但整合率高。 外源DNA 整合到染色體中概率很小，大約1/104 轉(zhuǎn)染細胞能整合，通常需要通過一些選擇性標記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移 酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B 磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細 胞系。

轉(zhuǎn)染技術的選擇對轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA 與轉(zhuǎn)染 試劑 比例，細胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測 時間等。一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術，如DEAE 右旋糖苷法，磷酸鈣法，電穿孔法，脂質(zhì)體法各有利弊，其主要原理及應 用特點見下表：

（各種轉(zhuǎn)染方法的比較） 除上述傳統(tǒng)方法外，近年來國際上推出了一些陽離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術，以其適用宿主范圍廣，操作簡便對 細胞毒性小，轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞。其中樹枝狀聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亞胺（Polyethylenimine， PEI）的轉(zhuǎn)染性能最佳，但樹枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進一步改性，且其合成工藝復雜。

聚乙烯亞胺是一種具有較 高的陽離子電荷密度的有機大分子，每相隔二個碳個原子，即每“第三個原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合 物網(wǎng)絡在任何pH 下都能充當有效的“質(zhì)子海綿"(proton sponge)體。這種聚陽離子能將各種報告基因轉(zhuǎn)入各種種 屬細胞，其效果好于脂質(zhì)聚酰胺，經(jīng)進一步的改性后，其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物，而且它的細胞毒性低。大量 實驗證明，PEI 是非常有希望的基因治療載體。

目前在設計更復雜的基因載體時，PEI 經(jīng)常做為核心組成成分。線 型PEI（Line PEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，過 去的研究認為在不考慮具體條件，LPEI/DNA 轉(zhuǎn)染復合物的細胞毒性較低，有利于細胞定位，因此與BPEI 相比應該 轉(zhuǎn)染效率高一些。

但最近研究表明BPEI 的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復合物，從而提高轉(zhuǎn)染效率，但同時細胞 毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI 衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實驗中發(fā)現(xiàn)這種PEI 的毒性低， 但轉(zhuǎn)染效率卻較高。

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