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    免疫細胞轉染實操時的幾大步驟說明

    發(fā)布時間： 2022-10-09　　點擊次數(shù)： 788次
     　　對于免疫細胞轉染實驗，我們拿脂質體為例，其作為體內和體外輸送載體的工具，已經研究的十分廣泛，中性脂質體是利用脂質膜包裹DNA，借助脂質膜將DNA導入細胞膜內。帶正電的陽離子脂質體，DNA并沒有預先包埋在脂質體中，而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上，形成DNA-陽離子脂質體復合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經過內吞被導入細胞。
    　　具體實操時的步驟如下：
    　　1.細胞培養(yǎng)：取6cm細胞皿，向每孔中加入2mL含1~2×105個細胞培養(yǎng)液，37℃二氧化碳培養(yǎng)密度至40%~60%，密度過大，轉染后不利篩選細胞。
    　　2.轉染液在EP管中制備(為轉染每一個孔細胞所用的量)：
    　　A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1ug質粒DNA；
    　　B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2ul脂質體。
    　　分別將A液與B液輕彈混勻，靜置5分鐘。
    　　3.吸取B液加入至A液中，輕彈混勻。室溫中置10-15分鐘。
    　　4.轉染準備：用1mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入4mL不含血清培養(yǎng)液。
    　　5.轉染：把A/B復合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37℃恒溫箱置6~24小時，吸除無血清轉染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
    　　6.瞬時轉染后，可在48-72h細胞長滿之后，提取細胞蛋白或者RNA，驗證敲減/過表達效率。
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