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    貼壁細胞傳代

    發(fā)布時間: 2022-10-18  點擊次數(shù): 1222次


    簡介


    在動物細胞培養(yǎng)過程中,必須有可以貼附的支持物表面,其依靠自身分泌或培養(yǎng)基中的貼附因子才能在該表面生長增殖的離體動物的培養(yǎng)細胞。

    由于血清具有終止胰蛋白酶消化,提供細胞生長所需的貼壁因子、免疫球蛋白、胰島素等其它營養(yǎng)成分及細胞因子,因此成為體外細胞培養(yǎng)液中的常用添加成分,其對細胞的培養(yǎng)意義重大。


    原理


    細胞在人工基質(zhì)上單層生長(貼壁培養(yǎng))
    貼壁細胞分類:皮細胞型,成纖維細胞型,游走細胞型和多型細胞型。

    在顯微鏡下觀察時,貼壁細胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不規(guī)則的三角形或扇形或其它形態(tài),而且晃動培養(yǎng)液時,細胞不動。

    培養(yǎng)細胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣;當與底物貼附后,細胞將逐漸伸展而形成一定的形態(tài),呈成纖維細胞樣或上皮細胞樣等。


    材料與儀器


    【材料與試劑】細胞、PBS 或 DPBS、0.25% (w/v) Trypsin-EDTA、75% 乙醇、培養(yǎng)基(以DMEM為例)、100X 雙抗(鏈霉素-青霉素)、胎牛血清、細胞凍存液。

    【實驗儀器與耗材】培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶、移液槍、離心管、記號筆、封口膜、凍存管、程序降溫凍存盒、液氮罐、離心機、37℃ 恒溫培養(yǎng)箱(5% 二氧化碳濃度)、倒置相差顯微鏡、冰箱、無菌細胞操作臺。


    步驟


    一、試劑準備
    DMEM*培養(yǎng)基(10% 胎牛血清):44.5 mL DMEM +5 mL 胎牛血清+500 μL 100X 雙抗,搖勻,4 ℃ 冷藏保存,使用前于 37 ℃ 恒溫水浴鍋中預(yù)熱 15 分鐘。

    PBS、*培養(yǎng)基、根據(jù)細胞特性選擇合適的解離液(例如Gibco? TrypLE? Express、胰蛋白酶)或機械吹打消化細胞、胰蛋白酶解離劑 0.25%  (w/v) Trypsin-EDTA 4℃ 冷藏保存,使用前于37 ℃ 恒溫水浴中鍋預(yù)熱 15 分鐘。

    二、 細胞復(fù)蘇
    1. 超凈工作臺使用前紫外線照射 30 分鐘。使用前,后用 75% 酒精擦拭臺面。保持臺面干凈整潔。使用時一定打開通風。

    2. 將凍存細胞從-80 度冰箱或液氮罐中取出,立即放入(2分鐘內(nèi))37 ℃ 恒溫水浴中預(yù)熱水浴鍋中(或在手心中反復(fù)摩擦),不?;蝿右曰瘍觥?/p>

    3. 立刻將化凍的細胞液轉(zhuǎn)移進裝有 3 mL DMEM*培養(yǎng)基的 5 mL離心管中并吸打均勻。注意液體不要留在瓶口或瓶蓋上,避免增加污染的可能。

    4. 復(fù)蘇細胞時,離心機提前降溫至4℃,以 1000 rpm 的轉(zhuǎn)速將細胞懸液離心 5 分鐘并棄上清(離心的速度和時間根據(jù)細胞系的不同有所差異)。

    5. 用 3 mL DMEM*培養(yǎng)基重懸細胞,并轉(zhuǎn)移進 6 cm細胞培養(yǎng)皿中,放入細胞培養(yǎng)箱中。

    6. 在顯微鏡下觀察復(fù)蘇細胞的狀態(tài)(是否為單個細胞懸液,有無成團,活細胞的比例),并及時(每48小時)更換DMEM*培養(yǎng)基。

    7. 當細胞密度占顯微鏡視野 80%-90% 時,應(yīng)進行細胞傳代。

    三、貼壁細胞傳代(以 6 cm細胞培養(yǎng)皿為例)
    1. 棄置原培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基,從培養(yǎng)皿邊緣加入 2 mL 預(yù)熱的PBS平衡鹽溶液潤洗細胞(注意不要直接沖到細胞表面),并棄置。

    2. 沿培養(yǎng)基側(cè)壁加入1 mL預(yù)熱的 0.25% (w/v) Trypsin-EDTA,使胰蛋白酶*覆蓋細胞表面。于細胞培養(yǎng)箱中孵育 2 min(孵育時間根據(jù)細胞系不同有所差異,如不確定細胞消化時間,每隔 1min 取出在顯微鏡下觀察,約有 50-70% 細胞飄起,即可繼續(xù)操作)。

    3. 向培養(yǎng)皿中加入1 mL *培養(yǎng)基中和Trypsin的作用,并輕輕吸打細胞表層數(shù)次。將細胞懸液轉(zhuǎn)移到 5 mL 離心管中,在室溫下以 1000 rpm 的轉(zhuǎn)速將細胞懸液離心 3 分鐘。

    4. 小心棄去離心管中的上清液,使用 1mL *培養(yǎng)基輕輕重懸細胞沉淀,使其*被吹打為單個細胞狀態(tài),盡量減少泡沫的產(chǎn)生。

    5. 進行細胞計數(shù)后以 1:3(1:3~1:6均可)的比例進行細胞傳代。

    6. 取三只新 6 cm 細胞培養(yǎng)皿,每只培養(yǎng)皿中加入 3 mL *培養(yǎng)基,將細胞懸液平均分配至三只培養(yǎng)皿中,蓋上蓋子后,按照畫“十字"的操作,將細胞搖勻。

    7. 細胞培養(yǎng)皿放入細胞培養(yǎng)箱中,繼續(xù)培養(yǎng),每天觀察細胞狀態(tài)并及時更換培養(yǎng)液。

    四、貼壁細胞凍存:
    1、細胞處于生長對數(shù)期且狀態(tài)良好時,收集細胞以便凍存;

    2、制備冷凍培養(yǎng)液(含DMSO),在 4°C 下保存。注:合適的冷凍培養(yǎng)基取決于細胞系種類。

    3、按照貼壁細胞傳代培養(yǎng)過程中用的操作,將細胞解離下來;

    4、600 g, 4℃ 離心 5 min 收集細胞,然后棄掉上清,從冰箱取出細胞凍存液重懸細胞,分裝至凍存管中;

    5、將凍存管移入程序降溫盒中,再將程序降溫盒放入 -80℃ 冰箱,過夜,第二天移至液氮罐中。


    注意事項


    1、嚴格進行無菌操作,每次拿取東西時應(yīng)使用75%乙醇噴灑表面進行充分消毒;

    2、細胞培養(yǎng)皿上應(yīng)清楚標記:操作人、時間、細胞系;

    3、化凍細胞速度應(yīng)快,盡量在 5 min 內(nèi)完成操作;

    4、離心管放入離心機前應(yīng)用封口膜纏繞;

    5、超凈臺使用前應(yīng)用紫外照射 30 min 以上;

    6、所有與細胞直接接觸的材料和儀器均應(yīng)處于無菌狀態(tài)

    7、如果使用培養(yǎng)瓶,在將其放回培養(yǎng)箱之前,若使用的培養(yǎng)瓶的瓶蓋不帶透氣孔,則需旋松瓶蓋,以便進行適當?shù)臍怏w交換;

    8、如果細胞培養(yǎng)基已冷藏(2-8°C),使用前在 37℃ 水浴鍋預(yù)熱;

    9、細胞培養(yǎng)基保持避光儲存;

    10、細胞培養(yǎng)基添加 FBS 后,將*培養(yǎng)基放入冰箱(2-8°C)以保持性能。并在 2-4 周內(nèi)使用含添加劑的培養(yǎng)基,以減少污染機率和 pH 值變化的影響;

     


    常見問題


    1. 所有與細胞直接接觸的材料和儀器均應(yīng)處于無菌狀態(tài)。

    2. 如遇Trypsin 消化不佳的細胞(如RAW264.7細胞),可以采取使用無菌的細胞刮刀輕柔的將細胞刮下再處理。

    3. DMSO 具有細胞毒性,復(fù)蘇細胞的過程操作要迅速,并用 3 倍體積以上的*培養(yǎng)基進行稀釋。

    4. 細胞復(fù)蘇后應(yīng)在 12~24 h 后觀察細胞狀態(tài)。如遇到細胞污染,應(yīng)立即丟棄細胞,并對環(huán)境進行消毒。

    5. 凍存細胞應(yīng)選擇傳代次數(shù)較少的細胞,當細胞傳代高于15 代后,細胞應(yīng)丟棄,復(fù)蘇新的細胞再進行試驗。

    6. 復(fù)蘇后的細胞不能立即進行試驗,需傳代 2-3 代,待細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定后,才可進行相關(guān)試驗。復(fù)蘇后細胞狀態(tài)不佳,可考慮重新復(fù)蘇;

    若重新復(fù)蘇后細胞狀態(tài)仍舊不佳,可考慮適當提高胎牛血清的比例(從10%提升至15%,最大提升至20%),待細胞狀態(tài)恢復(fù)后再使用平時使用的培養(yǎng)基。

    7. 如想收獲到更多數(shù)量的細胞,可以將 6 cm皿細胞懸液接種于10 cm皿中,并增大*培養(yǎng)基的使用量。

    8、復(fù)蘇細胞后細胞狀態(tài)差:1)首先,凍存細胞時選擇處于對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細胞;2)復(fù)蘇時,水浴鍋提前預(yù)熱至37℃,離心機提前降溫至 4℃;

    9、細胞交叉污染:1)培養(yǎng)細胞系時盡量不要多種細胞系同時培養(yǎng);2)不同細胞系培養(yǎng)基單獨配置,盡量不要交叉使用;3)注意操作規(guī)范;


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