銷售熱線

19126518388

  • 技術(shù)文章ARTICLE

    您當前的位置：首頁 > 技術(shù)文章 > 一氧化氮合酶免疫組化顯示實驗

    一氧化氮合酶免疫組化顯示實驗

    發(fā)布時間： 2023-01-13　　點擊次數(shù)： 968次

    簡介

    目前免疫組化多選用 SABC 法。

    一抗是特異性的針對檢測蛋白的單克隆或多克隆抗體（本實驗為兔抗大鼠 iNOS ）。

     

    二抗是生物素標記的針對一抗的抗體（本實驗為羊抗兔 IgG ）。

     

    三抗是針對生物素的鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物（streptavidin biotin complex，SABC）。

     

    這樣就可以通過逐級放大的方式，以過氧化物酶標記要檢測的蛋白（iNOS）。顯色液為二氨基聯(lián)苯胺（DAB）和雙氧水（H2O2）。

     

    顯色原理：過氧化物酶將 H2O2 分解，產(chǎn)生新態(tài)氧，使 DAB 氧化，生成棕黃色顆粒產(chǎn)物，可根據(jù)顏色反應(yīng)來判定一氧化氮合酶的有無或多少。本方法具有靈敏性高，背景低的優(yōu)點。

    原理

     一氧化氮合酶免疫組化顯示實驗的基本原理是一氧化氮合酶按調(diào)控條件分為組構(gòu)型（cNOS）和誘生型（iNOS）。前者按細胞類型又可分為神經(jīng)元組構(gòu)型（nNOS）和內(nèi)皮細胞組構(gòu)型（eNOS）。前述的組化方法不能區(qū)分上述 NOS 的具體分型，因此可以利用針對不同類型 NOS（nNOS、eNOS、iNOS）的特異性抗體，通過免疫組化方法進行顯示。

    材料與儀器

    器材：

    染色缸、載玻片、蓋片、吸管、吸水濾紙、小鑷子、解剖器材、灌注器材、石蠟切片機、濕盒、恒溫箱、冰箱、普通光學(xué)顯微鏡、大鼠或培養(yǎng)的細胞。

    試劑：
    ①兔抗大鼠 iNOS（一抗）
    ②羊抗兔 SABC 試劑盒［10％正常山羊血清、羊抗兔 IgG（二抗）、SABC（三抗）］
    ③3％H2O2-甲醇液
    ④0.01 mol ／ L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）
    ⑤0.01 mol ／ L 檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）
    ⑥ DAB 顯色液（DAB，6 mg ；0.05 mol ／ L PBS（pH 7.4），10 mL ；30％H2O2,0.01 mL 。過濾去除沉淀物。用時現(xiàn)配）
    ⑦雙氧水
    ⑧蘇木精染液
    ⑨梯度乙醇
    ⑩二甲苯
    ?4％多聚甲醛
    ?石蠟
    ?0.3％Triton X-100。

    步驟

    一氧化氮合酶免疫組化顯示實驗的基本過程可分為如下幾步：

     

    （一）腦組織石蠟切片


    A．將大鼠常規(guī)灌注固定，取腦組織塊，常規(guī)包蠟塊。

    B．石蠟切片，片厚5 μm 。

    C．常規(guī)脫蠟入水。

    D．0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    E．封閉內(nèi)源性過氧化物酶：3％H2O2-甲醇，室溫，15 min 。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    F．抗原熱修復(fù)：將切片浸入0.01 mol ／ L 檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），用微波爐或電爐熱處理（加熱至95 ℃ 后斷電，間隔5～10 min ，反復(fù)1～2 次 ）。自然冷卻后，在0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    G．封閉非特異抗原：向切片上滴加10％正常山羊血清，室溫或37 ℃ ，20～30 min 。甩去多余的血清，不洗。

    H．一抗孵育：滴加適當稀釋的一抗（兔抗大鼠iNOS），放入濕盒中，4 ℃ ，過夜。以  PBS 代替一抗做陰性對照。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    I．二抗孵育：滴加生物素化羊抗兔 IgG ，37 ℃ ，30 min 。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    J．三抗孵育：滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC），37 ℃ ，30 min 。0.01 mol ／ L PBS中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    K．顯色：用 DAB 顯色液顯色，顯微鏡下監(jiān)測，適時終止。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    L．蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。

    （二）細胞爬片或甩片


    A．細胞爬片或甩片，0.01 mol ／ L PBS 漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    B．4％多聚甲醛固定，室溫，30 min 。0.01 mol ／ L PBS 漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    C．封閉內(nèi)源性過氧化物酶：3％H2O2-甲醇，室溫，10 min 。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    D．暴露抗原：0.3％Triton X-100，室溫，10 min 。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    E．封閉非特異抗原：滴加10％正常山羊血清，室溫或37 ℃ ，20～30 min 。甩去多余的血清，不洗。

    F．一抗孵育：滴加適當稀釋的一抗（兔抗大鼠iNOS），濕盒中，4 ℃ ，過夜。以不加 PBS 代替一抗做陰性對照。0.01 mol ／ L PBS中 漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

     

    G．二抗孵育：滴加生物素化羊抗兔 IgG ，37 ℃ ，1 h 。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。


    H．三抗孵育：滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC），37 ℃ ，1 h 。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    I．顯色：用 DAB 顯色液顯色，顯微鏡下監(jiān)測，適時終止。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    J．蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。

    注意事項

    1．一抗的質(zhì)量是關(guān)系到實驗結(jié)果的最關(guān)鍵因素，一定要選用高質(zhì)量的抗體。

    2．一抗、二抗、三抗的稀釋濃度、孵育時間、孵育溫度是十分重要的環(huán)節(jié)。在實際操作中，應(yīng)根據(jù)自身實驗室的條件探索合適的制備方法。

     

    3．DAB 顯色液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，最早在使用前15 min 配制。

    4．實驗操作過程中防止出現(xiàn)干片，否則會出現(xiàn)假陽性。為了正確估計是否是因為操作過程造成的人工假象，設(shè)立陰性對照十分必要。

    5．細胞爬片固定時采用室溫，是為了防止細胞脫落。以后每步操作都要小心，防止細胞脫落。

     

    以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。

     

    安培生物科技有限公司介紹：

    安培生物堅持為生命科學(xué)研究、活體動物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細胞治療領(lǐng)域客戶，提供*細胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑；inviCELL™Platelet lysate無動物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細胞擴增和生產(chǎn)，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞和多種免疫細胞系等，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無血清細胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)；提供以植物生物為平臺基因序列全人源化、*的細胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對細胞無毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)，努力發(fā)展為基因治療、細胞治療的生物科技企業(yè)。

     

產(chǎn)品中心 Products