CHO細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)驗(yàn)分享

簡(jiǎn)介：
CHO細(xì)胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）一個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，1957年從中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞得到。CHO細(xì)胞目前是現(xiàn)代制藥企業(yè)進(jìn)行研發(fā)、生產(chǎn)生物治療藥物 (單抗、酶、激酶和激素等) 中常用的非人類哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。

原理：
培養(yǎng)基無特殊要求，可有多種選擇,一般用DMEM（高糖）培養(yǎng)基+10%胎牛血清+2%雙抗。置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔48h換液，或當(dāng)培養(yǎng)基呈現(xiàn)熒光黃色及時(shí)換液，否則細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)大規(guī)模脫落和變形死亡。

當(dāng)單層培養(yǎng)細(xì)胞匯合達(dá)90%以后(兩天左右)，棄去培養(yǎng)基，用2ml不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗2次，用0.5mlPBS+0.5ml 含0.25%ETDA的胰蛋白酶消化1-2min（在培養(yǎng)箱放30s-1min），鏡下觀察變圓或輕輕擊打培養(yǎng)皿側(cè)壁發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞團(tuán)塊脫落或皿底花斑狀，用1ml（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，九宮格法吹落細(xì)胞收集到離心管，以800-1000rpm，室溫離心5min。

以1:2~1:3的比例傳代，離心棄去廢液，用2ml~3ml（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基充分重懸細(xì)胞沉淀成單個(gè)細(xì)胞，以“Z"字打入含有7ml培養(yǎng)基的10cm皿中，輕柔十字晃勻不超過十下并靜置數(shù)分鐘后鏡下觀察，平穩(wěn)放入培養(yǎng)箱中。

凍存液的配置為血清：二甲基亞砜(DMSO)=9:1。取長(zhǎng)勢(shì)良好，匯合度達(dá)90%并無污染的細(xì)胞，消化離心后用凍存液1.5ml重懸后轉(zhuǎn)移至凍存管中，標(biāo)記好細(xì)胞種類、日期、姓名，放入恢復(fù)室溫的梯度凍存盒，一同放置于-80°C冰箱。

準(zhǔn)備好離心管中放入3ml（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基，并確保水浴鍋打開并達(dá)到37℃，從-80℃冰箱取出目標(biāo)凍存管，放入密封袋并在水浴鍋中迅速搖晃解凍<1min，與3mL培養(yǎng)基混合均勻。在800 rpm，離心5分鐘，棄去上清液，用新培養(yǎng)基重懸細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)，加入10cm皿中，培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

注意事項(xiàng)：

1.CHO細(xì)胞對(duì)損傷不易耐受，請(qǐng)注意密切觀察。

2.不同胰酶消化速度有差別，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)調(diào)整用量和用時(shí)。

3.細(xì)胞傳代用PBS洗的目的是去除舊培養(yǎng)基中血清對(duì)胰酶的抑制作用。

4.不要將細(xì)胞中液體吸凈后放置過久，細(xì)胞變干后死亡。

5.細(xì)胞消化所用胰酶的最適工作溫度大約在37攝氏度左右，故放入培養(yǎng)箱更好的促進(jìn)胰酶消化。

6.細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，才能最大限度的保存細(xì)胞活力。（細(xì)胞保護(hù)劑（DMSO）能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇時(shí)快速融化，避免由于緩慢融化使細(xì)胞外結(jié)晶的水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷）。

7.細(xì)胞凍存嚴(yán)格遵循梯度降溫，不可直接放入低溫冰箱，如果沒有梯度凍存盒，可以4℃ 10-30min，-20℃ 30-1h，-80℃過夜。

8.復(fù)蘇后第二天換液是為了去除殘留凍存液對(duì)細(xì)胞的傷害。

9.細(xì)胞量少或凍存過久的細(xì)胞復(fù)蘇到中皿中，等長(zhǎng)滿后傳代到大皿中。

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