質(zhì)粒構(gòu)建的心得分享

質(zhì)粒是我們?nèi)粘?shí)驗(yàn)中比較常用的載體，其可以自主生長(zhǎng)，也能通過比較容易的方法進(jìn)行大量擴(kuò)增，但往往單一的質(zhì)粒不能滿足實(shí)驗(yàn)需求，需通過一系列方法進(jìn)行質(zhì)粒重組，我目前比較常用的方法也就是比較陳舊的酶切重組質(zhì)粒的方式，簡(jiǎn)易實(shí)驗(yàn)過程如下圖：

在這個(gè)過程中，有幾個(gè)小Tips：

1.原載體的酶切位點(diǎn)由文獻(xiàn)、載體說明書或者導(dǎo)師建議得來，選擇正確的酶切位點(diǎn)是重組質(zhì)粒開始的第一步，常見的酶切體系如下：

上述體系適用于大多數(shù)酶切，不是特別難切開的載體1μl內(nèi)切酶足夠，酶切前計(jì)算好量，先加ddH2O，最后加內(nèi)切酶。

2.酶切完成后，需要跑瓊脂糖膠鑒定酶切效果，配膠時(shí)注意選擇合適的膠濃度，原則是分子量越大，膠濃度越小。跑膠完成后紫外燈下一般會(huì)有兩段即為成功：載體和切下來的片段，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行膠回收，注意切下來的片段不回收，膠回收完成后測(cè)濃度備用。

3.插入片段根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)選擇，通常插入片段可以通過PCR而來，或者是一段由三方公司合成的序列，在連接開始前也需要用同樣的兩個(gè)內(nèi)切酶切出缺口。常見連接體系如下：

其中，加入載體和插入片段的量由說明書得來，加樣前計(jì)算好量，先加ddH2O，最后加連接酶，由于連接體系較小，一般使用pcr管進(jìn)行。

4、為確保連接的順利進(jìn)行，務(wù)必保證連接酶和連接酶緩沖液配套使用，即使用同一廠家的，不能混用。

測(cè)序的準(zhǔn)確性對(duì)于后續(xù)慢病毒感染是非常重要的，因此測(cè)序公司的選擇十分重要，尤其出現(xiàn)一些比較難測(cè)的結(jié)構(gòu)如shRNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)等，測(cè)序技術(shù)不成熟的話會(huì)一直報(bào)重疊峰或者測(cè)不通的情況。

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