Lipofectamine ™ RNAiMAX轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染是實(shí)驗(yàn)過程中常用的技術(shù)操作，通俗來說，常見的轉(zhuǎn)染即為把某種功能性質(zhì)粒轉(zhuǎn)到細(xì)胞中去，通過轉(zhuǎn)染試劑的作用在經(jīng)過一段時間后，收集細(xì)胞通過WB、qpcr等來檢測質(zhì)粒是否正常發(fā)揮作用來達(dá)到我們實(shí)驗(yàn)的某種需求；不同的質(zhì)粒通常有不同的轉(zhuǎn)染試劑和不同的方法，如PEI轉(zhuǎn)染、lipo2000轉(zhuǎn)染等。

Lipofectmine ™ RNAiMAX轉(zhuǎn)染主要供siRNA和Stealth ™ RNAi 雙鏈體轉(zhuǎn)染使用，具有轉(zhuǎn)染效率高、對細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)，分為正向轉(zhuǎn)染及反向轉(zhuǎn)染兩種方式。siRNA轉(zhuǎn)染比較常見，因此本文分享主要針對siRNA反向轉(zhuǎn)染。

轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備

1.準(zhǔn)備試劑包括：Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine™ RNAiMAX試劑、siRNA、不加雙抗的10%FBS培養(yǎng)基、胰酶、PBS緩沖液等常見處理細(xì)胞的試劑。

2.反向轉(zhuǎn)染要求細(xì)胞密度≥90%。

轉(zhuǎn)染中

1.按正常處理細(xì)胞的流程將長滿的細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化離心后去上清，注意此處需要加無雙抗的10%FBS培養(yǎng)基1ml進(jìn)行細(xì)胞重懸，重懸完后根據(jù)細(xì)胞生長速度鋪細(xì)胞，保證轉(zhuǎn)染完后24h細(xì)胞密度達(dá)到30-50%。

2.轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備：根據(jù)說明書制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，添加量如下表所示。

根據(jù)轉(zhuǎn)染的實(shí)際情況將Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine™ RNAiMAX試劑、siRNA依次加入到一個無菌Ep管中，按照先加Opti-MEM培養(yǎng)基、再加siRNA最后加Lipofectamine™ RNAiMAX試劑的順序，輕輕混勻室溫孵育20min。

3.20min后依次將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)皿種，輕輕混勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。

轉(zhuǎn)染后

1.轉(zhuǎn)染后24h內(nèi)最好不要挪動細(xì)胞，也不要拿出在顯微鏡下觀察，期間也無需進(jìn)行細(xì)胞換液。

2.轉(zhuǎn)染后48h后，可拿出細(xì)胞觀察細(xì)胞形態(tài)有無變圓，肉眼觀察轉(zhuǎn)染效率，對于生長較慢的細(xì)胞，其表型可能會在72h內(nèi)逐漸顯現(xiàn)。根據(jù)細(xì)胞生長情況可進(jìn)行換液，注意此時需要換含雙抗的血清培養(yǎng)基。

3.在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，若細(xì)胞變圓較為厲害，應(yīng)在轉(zhuǎn)染后4天左右收細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率測定，時間太久細(xì)胞太少的話檢測難度較大。

4.此種轉(zhuǎn)染方式最長可維持5-7天的基因敲除效果。

注意事項(xiàng)

1. Lipofectamine™ RNAiMAX試劑在冰箱4℃保存，切記不能冷凍。

2. Lipofectamine™ RNAiMAX試劑不宜在室溫放置過久，因此在制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物前從冰箱拿出，加完后應(yīng)立即放回4℃再進(jìn)行后續(xù)操作。

3.轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備完成后室溫孵育時間不得超過20min，因此建議將細(xì)胞鋪好板后十字混勻，暫放于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，再進(jìn)行轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備。

4.siRNA應(yīng)于-80℃保存。

5.在處理細(xì)胞重懸時一定要使用無雙抗的10%FBS培養(yǎng)基，避免細(xì)胞死亡，如果在鋪板后還要進(jìn)行細(xì)胞傳代也沒有影響，直接用上述混懸液傳代即可。

6. Lipofectamine ™ RNAiMAX轉(zhuǎn)染的兩種方式差別不是很大，主要區(qū)別在于正向轉(zhuǎn)染需要提前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，第二天直接加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物，同時還需要在轉(zhuǎn)染后4-6h進(jìn)行細(xì)胞換液。反向轉(zhuǎn)染速度比正向轉(zhuǎn)染更快，操作較為簡潔，因此更建議使用反向轉(zhuǎn)染。

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