miRNA的逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR

microRNA(miRNA)是一種長(zhǎng)度約為19-25nt單鏈RNA，一般參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)。作為非編碼RNA（ncRNA），目前大量的研究顯示一些差異表達(dá)miRNA在眾多的疾病中扮演著重要的角色，而了解miRNA差異表達(dá)，熒光定量PCR是最基礎(chǔ)、應(yīng)用最多的檢測(cè)和定量miRNA的方法。

由于miRNA的長(zhǎng)度比較短，因此傳統(tǒng)的熒光定量并不適用，下面介紹的兩種方法的最根本的原理其實(shí)就是延長(zhǎng)miRNA.因此在這里分享了關(guān)于miRNA進(jìn)行qPCR的兩種方法和一些經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：

一、提取細(xì)胞、血清或外泌體RNA

就目前而言，針對(duì)不同樣品TRIZOL法提取RNA是比較通用的提取RNA的試劑，但是也具有相應(yīng)的提取試劑盒（血清RNA提取試劑盒），目前一般均使用的是TRIZOL法提取的total RNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，但有文獻(xiàn)說(shuō)明TRIZOL法可能會(huì)導(dǎo)致miRNA丟失，也可選擇miRNA提取試劑盒。

二、miRNA的qPCR

1.miRNA莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄 + miRNA熒光定量PCR

原理：在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中我們需要設(shè)計(jì)一個(gè)莖環(huán)引物與我們miRNA序列結(jié)合起到延長(zhǎng)miRNA的作用。而莖環(huán)引物是一個(gè)長(zhǎng)度約為45bp且能夠自身環(huán)化的引物。每一個(gè)miRNA都具有自己特異的莖環(huán)引物。這最重要的原因就是設(shè)計(jì)的莖環(huán)引物中包含一段與miRNA互補(bǔ)序列有關(guān)：莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物 =5’端的莖環(huán)序列+3’端的miRNA的特定互補(bǔ)序列。

①莖環(huán)引物的設(shè)計(jì)：

首先我們?cè)趍iRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)到miRNA的成熟序列(5’-3’)，利用excel中的替換功能將序列中的U全部換成T，一般地通用的莖環(huán)引物序列如CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC3’ 或者5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC3’，紅色部分的序列可形成自身環(huán)化。

另外，針對(duì)特定miRNA設(shè)計(jì)的莖環(huán)引物：只需要在通用莖環(huán)引物3’端加上miRNA的成熟序列中的U更換成T后的序列3’端開(kāi)始數(shù)6-8個(gè)堿基（一般選擇6個(gè)）的反向互補(bǔ)序列加在莖環(huán)通用序列的3’端即可，這樣就得到某個(gè)miRNA的莖環(huán)引物。

以hsa-miR-30b-5p為例，其成熟序列為UGUAAACAUCCUACACUCAGCU，U全部換成T：TGTAAACATCCTACACTCAGCT；則其莖環(huán)引物為：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTGA-3′

②逆轉(zhuǎn)錄（RT）：去除基因組DNA + 逆轉(zhuǎn)錄（可使用miRNA專(zhuān)用的莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）

1）去基因組DNA（2ul基因組去除試劑）；

2）RNA體積：根據(jù)提取RNA濃度來(lái)定+free-RNase H2O(to 10ul);

3)吹打混勻，42度反應(yīng)2min；

4)逆轉(zhuǎn)錄：1ul莖環(huán)引物（stem-loop）+試劑盒中逆轉(zhuǎn)錄MIX（2ul+2ul）+free-RNase H2O（5ul）(to 20 ul)

5)一般來(lái)說(shuō)，一次逆轉(zhuǎn)錄只能進(jìn)行一個(gè)miRNA的單獨(dú)逆轉(zhuǎn)錄，但是根據(jù)實(shí)際情況而言，我們可以將miRNA+內(nèi)參U6混合在一管中一同逆轉(zhuǎn)成cDNA。

根據(jù)以上試劑盒設(shè)計(jì)的加樣量，我嘗試過(guò)一管內(nèi)混合逆轉(zhuǎn)錄內(nèi)參+5個(gè)miRNA，其中主要的變化就是在第一步增大所加入RNA的量，在第二步加莖環(huán)引物時(shí)，我們可以將所加入的free-RNase H2O（5ul）替換成不同的莖環(huán)引物(5個(gè))，這種方式在特異性的基礎(chǔ)上又比較高效的合成多個(gè)miRNA，雖然節(jié)省試劑，但是也存在弊端，例如我們加入Mix(包含酶或dNTP等)都是一定量的，加入過(guò)多的莖環(huán)引物合成最終的各種miRNA的cDNA產(chǎn)物可能存在濃度過(guò)低，混合不勻可能會(huì)影響后續(xù)的熒光定量。

③熒光定量（qPCR）

5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTGA-3′，則通用反向引物為：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′

2)熒光定量：10ul體系（20ul體系減半）(SYBR染料法)：

5ulSYBR+1ulcDNA+2ulfree-RNase H2O+2ul正反引物（提前混合）

例如：RT-qPCR分析hsa-miR-30b-5p的差異表達(dá)水平，以U6為內(nèi)參：

對(duì)照組+處理組：此時(shí)為了減小誤差bar的大小做4個(gè)復(fù)孔，以八聯(lián)管為例：

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