酵母雙雜交(Y2H)實驗操作指南

酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two hybrid，Y2H) 常用于分析兩種蛋白質(zhì)的相互作用。將兩種蛋白質(zhì)分別克隆到酵母表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活域（AD）上，構(gòu)建成融合表達(dá)載體，從而分析兩種蛋白質(zhì)的相互作用。

一、酵母感受態(tài)細(xì)胞制備

(1) 將-80℃保存的酵母菌株在YPDA固體培養(yǎng)基平板上劃線，30℃培養(yǎng)條件下倒置培養(yǎng)4-7d。

(2) 挑取單菌落至含3mLYPDA液體培養(yǎng)液中。

(3) 30℃培養(yǎng)，200rpm 震蕩培養(yǎng)8h。

(4) 當(dāng)菌液OD值約為0.3時，轉(zhuǎn)移10uL菌液到含50mIYPDA培養(yǎng)液中。

(5) 30℃培養(yǎng)，200rpm震蕩培養(yǎng)16-20h至OD值為015-0.3。

(6) 700g轉(zhuǎn)速5min室溫離心收集細(xì)胞。

(7) 將底部沉淀使用已預(yù)熱至30℃的100mLYPDA中重懸酵母細(xì)胞。

(8) 30℃，200rpm，搖3-5h至OD值=0.6時。

(9) 5min室溫離心收集細(xì)胞。

(10) 將底部沉淀在30mL無菌超純水中重懸酵母細(xì)胞.

(11) 700g轉(zhuǎn)速5min室溫離心收集細(xì)胞。

(12) 將底部沉淀加入3mL的1.1XTE/LiAc重懸細(xì)胞。

(13) 將懸重懸細(xì)胞分成2管，6000g轉(zhuǎn)速室溫離心30s。

(15) 將底部沉淀加入500uL的1XTE/LiAc重懸酵母細(xì)胞，分裝為100uL每管。

二、轉(zhuǎn)化

（1）在干凈的1.5 mL的離心管中并振蕩混勻。

（2）每個離心管中加入100 µL的酵母感受態(tài)細(xì)胞，500 µL的PEG/LiAc溶液，加入兩種質(zhì)粒，并且將管中的混合物進(jìn)行旋渦振蕩，將其混勻。

（3）在30℃，220 rpm/min的搖床振蕩培養(yǎng)30 min。

（4）往每個離心管中加70 µL的DMSO，并溫和的上下顛倒混勻。將離心管在42℃水浴中熱激40 min（每隔10 min搖勻1次）。

（5）取出離心管，在冰上靜置2 min。

（6）吸取100 µL并涂布在相應(yīng)的二缺固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3-4天，待菌長好后，挑單菌落于10ulYPDA液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜。

互作驗證：

取過夜培養(yǎng)的菌液涂布于四缺平板上，將培養(yǎng)皿置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察是否生長與顏色變化。

注意事項：

（1）檢測感受態(tài)細(xì)胞效率，標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范。

（2）注意質(zhì)粒使用量，檢查儀器狀態(tài)。

（3）配制新鮮培養(yǎng)基，并做對照轉(zhuǎn)化，添加抑制劑，同時增設(shè)嚴(yán)格的對照組防止自激活。

（4）應(yīng)挑選大的、新鮮的菌株克隆進(jìn)行培養(yǎng)。

以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。

安培生物致力成為推動生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實力、先進(jìn)的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)。總部設(shè)在廣東，服務(wù)面向全國。安培生物集進(jìn)口試劑、實驗室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線，在各個領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機(jī)構(gòu)、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。

可以在第一時間為用戶提供比較先進(jìn)的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務(wù)。 專業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠為廣大用戶提供強(qiáng)大的技術(shù)支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進(jìn)的高科技產(chǎn)品推薦給國內(nèi)從事生物學(xué)領(lǐng)域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應(yīng)商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨，配合優(yōu)秀的銷售隊伍以及專業(yè)的技術(shù)支持，隨時為客戶提供服務(wù)。