24條細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)

什么是細(xì)胞培養(yǎng)？

細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境（無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營(yíng)養(yǎng)條件等），使之生存、生長(zhǎng)、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。

不論對(duì)于整個(gè)生物工程技術(shù)，還是其中之一的生物克隆技術(shù)來說，細(xì)胞培養(yǎng)都是一個(gè)非常重要的過程，細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的大規(guī)?？寺?。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成為簡(jiǎn)單的單細(xì)胞或極少分化的多細(xì)胞，這是克隆技術(shù)中十分重要的環(huán)節(jié)，而且細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的克隆。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)研究方法中重要和常用技術(shù)，通過細(xì)胞培養(yǎng)既可以獲得大量細(xì)胞，又可以借此研究細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的合成代謝、細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖等。

細(xì)胞培養(yǎng)總會(huì)遇到細(xì)胞污染、胞質(zhì)疏松，狀態(tài)不好，養(yǎng)不起來等等問題。接下來就給你們介紹一些常見問題解決方法。

細(xì)胞培養(yǎng)的菜鳥問題集

1.冷凍管應(yīng)如何解凍？

取出冷凍管后，須立即放入37°C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。

2.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除DMSO？

除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，可直接放入10-15ml新鮮培養(yǎng)基，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長(zhǎng)或貼附之問題。

3. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？

不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細(xì)胞可能無法立即適應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)不好甚至死亡。

4. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清？

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無法存活。

5. 培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用多少濃度的CO2？5%還是10%，或根本沒有影響？

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7 g時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10% CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5 g時(shí)，則應(yīng)使用5% CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。

6. 何時(shí)須更換培養(yǎng)基？

視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

7. 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？

除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素，但實(shí)際操作中有時(shí)會(huì)加入1%的青鏈霉素來避免細(xì)菌污染。

8. 貼壁細(xì)胞繼代時(shí)該使用多少濃度的trypsin-EDTA？

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一般使用濃度為0.05% trypsin-0.53mM EDTA·4Na。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20 °C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機(jī)會(huì)。

9. 懸浮細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？

一般僅需在原培養(yǎng)瓶中持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多，可將培養(yǎng)瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞的培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。

10. 一般動(dòng)物細(xì)胞的離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

欲回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為300 g (約1,000 rpm)，5-10分鐘，過高轉(zhuǎn)速將造成細(xì)胞死亡。

11. 合適的細(xì)胞接種密度是多少？

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)過慢。

12. 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基的成份是哪些？

動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide)和90-95 %原來細(xì)胞生長(zhǎng)用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成、且需提前放在4 °C預(yù)冷。

13. DMSO的等級(jí)和無菌過濾方式？

冷凍保存使用的DMSO等級(jí)必須為Tissue culture grade，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，避光保存。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO的Nylon材質(zhì)濾膜。

14. 細(xì)胞凍存的步驟是什么？

凍存方法一：冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

凍存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 °C至–80 °C以下，再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20 °C 不可超過1 小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中，但存活率會(huì)降低。

15. 凍存時(shí)細(xì)胞密度為多少比較合適？

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以5x106cells/ml vial為宜。

16. 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？

細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。造成細(xì)胞污染的主要原因有無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、實(shí)驗(yàn)耗材污染、血清污染和細(xì)胞來源污染等。嚴(yán)格的無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境和品質(zhì)良好的細(xì)胞來源是避免污染的最好方法。

17. 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理？

直接滅菌后丟棄之。

18. 支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？

支原體污染幾乎可影響細(xì)胞所有的生長(zhǎng)參數(shù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果方有意義。

19. 偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)，該如何處理？

直接滅菌后丟棄是最佳的方法，以避免污染其它細(xì)胞株。但如果樣品比較珍貴，可以購(gòu)買市面上現(xiàn)有的支原體去除試劑，嘗試拯救一下。

20. CO2培養(yǎng)箱的水盤如何保持清潔？

定期更換無菌蒸餾水或無菌去離子水(至少每?jī)芍芤淮?。

21. 為何培養(yǎng)基保存于4 °C冰箱中，顏色會(huì)偏暗紅色，且pH值會(huì)越來越偏堿性？

培養(yǎng)基保存在4 °C冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)的CO2會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑(通常為phenol red)的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。

22. 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？

不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，但對(duì)大部分細(xì)胞沒有太大之影響，只有少數(shù)細(xì)胞可能會(huì)因使用不同廠牌的dish或flask而表現(xiàn)出生長(zhǎng)差異。

23. 購(gòu)買的細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少的情形？

研究人員在解凍細(xì)胞后出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少，大都是因?yàn)殡x心過程操作上的失誤，造成細(xì)胞的物理性損傷，以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心，待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

24. 購(gòu)買的細(xì)胞出現(xiàn)死亡率高或狀態(tài)不佳的可能原因？

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80 °C太久。

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